化學發(fā)光染液工作原理：以常用于免疫印跡（Western Blot）實驗的增強化學發(fā)光（ECL）染液為例，其核心反應體系圍繞辣根過氧化物酶（HRP）和魯米諾構建。在檢測過程中，首先 HRP 標記的抗體與膜上的目標蛋白特異性結合，形成抗原 - 抗體 - HRP 復合物。隨后加入含有魯米諾和過氧化氫的 ECL 工作液，在 HRP 的催化作用下，過氧化氫分解產生氧自由基。氧自由基具有強氧化性，會將魯米諾氧化為激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸。處于激發(fā)態(tài)的 3 - 氨基鄰二甲酸不穩(wěn)定，當它回到基態(tài)時，會以光的形式釋放多余能量，從而產生化學發(fā)光信號。該信號的強度與目標蛋白的含量相關，通過檢測發(fā)光信號的強度和位置，即可確定目標蛋白的存在和含量。為了進一步提高檢測靈敏度，一些 ECL 發(fā)光染液中還添加了特殊的增強劑，這些增強劑能夠與反應中間產物結合，穩(wěn)定激發(fā)態(tài)分子，減少能量損失，顯著增強發(fā)光信號并延長發(fā)光時間，使檢測靈敏度可達到飛克（fg，10?1?g）級別，能夠檢測到極低含量的目標蛋白 。

熒光發(fā)光染液工作原理：熒光蛋白發(fā)光染液利用了熒光染料與蛋白質結合后在特定波長光激發(fā)下發(fā)出熒光的特性。以 DyLight 系列熒光染料為例，這類染料具有良好的水溶性、pH 不敏感性、高亮度、光穩(wěn)定性以及較長的圖像采集時間等優(yōu)點。其與蛋白質的結合主要通過與蛋白質的氨基或巰基等活性基團發(fā)生共價結合，從而實現(xiàn)對蛋白質的標記。當被標記的蛋白質受到合適的激發(fā)光照射時，熒光染料分子吸收光子能量，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。由于激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，電子會迅速從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，在此過程中以光的形式釋放能量，發(fā)出特定波長的熒光。科研人員通過熒光成像設備檢測熒光信號的強度和分布，從而對蛋白質進行定性和定量分析。不同的熒光染料具有不同的激發(fā)和發(fā)射光譜，這使得科研人員可以根據(jù)實驗需求選擇合適的熒光染料，實現(xiàn)對多種蛋白質的同時檢測。例如在多重免疫熒光實驗中，使用不同激發(fā)和發(fā)射光譜的熒光染料標記不同的抗體，一次實驗即可檢測多個目標蛋白，通過不同顏色的熒光信號直觀展示各蛋白質在細胞或組織中的定位和表達情況 。